人胰島素(INS)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒使用說明書

實驗原理 ：

本試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA) 。往預(yù)先包被有人胰島素(INS) 捕獲抗體的微孔中， 依次加入樣本、標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記的檢測抗體，HRP 酶結(jié)合物，中間經(jīng)過溫育和洗滌，用底物 TMB 顯色，TMB 在過氧化物酶(HRP)的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人胰島素  (INS) 呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm 波長下測定吸光度 (OD 值) ，計算樣品濃度。

操作步驟 ：

1.  從室溫平衡 10 分鐘后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2.  加樣：分別將樣品或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品按照 100 μ l 每孔加入相應(yīng)孔中，空白孔加入 100μL 通用稀釋液。蓋 上封板膜后 37℃溫育 1 小時。  (建議：將待測樣本用通用稀釋液稀釋 1 倍后再加入酶標(biāo)板內(nèi)測試。從 而減少基質(zhì)效應(yīng)對測試結(jié)果的誤差影響，最后計算樣本濃度時需乘以對應(yīng)的稀釋倍數(shù)。所有的待測樣本和 標(biāo)準(zhǔn)品在檢測中建議設(shè)立復(fù)孔) 。

3.  加生物素化抗體：取出酶標(biāo)板，棄去液體，不用洗滌。每孔直接加入生物素化抗體工作液 100 μL，蓋上封 板膜后 37℃溫育 1 小時。

4.  洗板：棄去液體，每孔加入 300 μL 1x 洗滌液，靜置 1 分鐘，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板

3 次 (也可用洗板機洗板) 。

5.  加酶結(jié)合物工作液：每孔加入酶結(jié)合物工作液 100 μL，蓋上封板膜后 37℃溫育 30 分鐘。

6.  洗板：棄去液體按步驟 4 洗滌方法，洗板 5 次。

7.  加底物：每孔加入底物(TMB)90 μL，蓋上封板膜，37℃避光溫育 15 分鐘。

8.  加終止液：取出酶標(biāo)板，每孔直接加入終止液 50 μL，立即在 450nm 波長處測定各孔的OD 值。

結(jié)果判斷：

1.  計算標(biāo)準(zhǔn)品和樣本復(fù)孔的平均 OD 值并減去空白孔的OD 值作為校正值。以濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)， 在雙對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(作圖時去掉空白組的值)。

2.  若樣品OD 值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

典型數(shù)據(jù)和參考曲線：

以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實驗者需根據(jù)自己的實驗建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

試劑盒性能 ：

1.  重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于 10%，板間變異系數(shù)小于 10%。

2.  回收率：在選取的健康人血清、血漿和組織勻漿中加入 3 個不同濃度水平的人 INS，計算回收率

3.  線性稀釋：分別在選取的 4 份健康人血清、血漿和組織勻漿中加入高濃度人 INS，在標(biāo)準(zhǔn)曲線動力學(xué)范圍

內(nèi)進行稀釋，評估線性。評估線性。

本試劑盒只能用于科學(xué)研究，不得用于醫(yī)學(xué)診斷          6

注意事項：

1.  嚴(yán)格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達到室溫 20-25℃ 。使用

后立即冷藏保存試劑。

2.  洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。

3.  消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD 值。

4.  底物顯色液應(yīng)呈無色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍的底物液不能使用。

5.  避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯誤結(jié)果。

6.  在儲存和溫育時避免強光直接照射。

7.  平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。

8.  任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應(yīng)試劑

的生物活性。

9.  不能使用過期產(chǎn)品。

10. 如果可能傳播疾病，所有的樣品都應(yīng)管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。