PRODUCT CLASSIFICATION
產(chǎn)品分類技術(shù)文章/ Technical Articles
人唾液皮質(zhì)醇(SC)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒使用說(shuō)明書
Human salivary cortisol(SC) ELISA Kit
產(chǎn)品貨號(hào):RJ13602
產(chǎn)品規(guī)格:96T/48T
實(shí)驗(yàn)原理:
本試劑盒采用競(jìng)爭(zhēng)法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。往預(yù)先包被有人唾液皮質(zhì)醇(SC)抗體的微孔中,依次加入樣本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的抗原,中間經(jīng)過(guò)溫育和洗滌,用底物TMB顯色,TMB在過(guò)氧化物酶(HRP)的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人唾液皮質(zhì)醇(SC)呈負(fù)相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值),計(jì)算樣品濃度。
試劑盒組成:
名稱 | 96孔配置 | 48孔配置 | 備注 |
預(yù)包被96孔酶標(biāo)板 Pre-coated Assay Plate | 8孔×12條 | 8孔×6條 | 無(wú) |
標(biāo)準(zhǔn)品 Standard | 2支 | 1支 | 按說(shuō)明書進(jìn)行稀釋 |
通用稀釋液 Universal Diluent | 2x20mL | 1x20mL | 無(wú) |
濃縮HRP-抗原 HRP-antigen(100×) | 60μL | 30μL | 按說(shuō)明書進(jìn)行稀釋 |
20×洗滌液 Wash Buffer (20×) | 2x10mL | 1x10mL | 按說(shuō)明書進(jìn)行稀釋 |
底物(TMB) TMB Substrate | 10mL | 5mL | 無(wú) |
終止液 Stop Solution | 6mL | 3mL | 無(wú) |
封板膜 Plate Sealer | 4張 | 4張 | 無(wú) |
說(shuō)明書 Instruction Manual | 1份 | 1份 | 無(wú) |
預(yù)包被96孔酶標(biāo)板 Pre-coated Assay Plate | 8孔×12條 | 8孔×6條 | 無(wú) |
試劑盒參數(shù):
性能 | |
靈敏度 | 0.187ng/mL |
檢測(cè)范圍 | 0.312-20ng/mL |
重復(fù)性 | 板內(nèi)變異系數(shù)小于10%,板間變異系數(shù)小于10%. |
特異性 | 可檢測(cè)樣本中人的SC,且與其類似物無(wú)明顯交叉反應(yīng). |
需自備的設(shè)備及試劑:
1. 450±10nm 濾光片酶標(biāo)儀
2. 高精度加樣器及槍頭:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL.
3. Eppendorf 移液器.
4. 蒸餾水或去離子水.
5. 脫脂棉吸水紙.
6. 37℃恒溫箱.
8. 準(zhǔn)備若干個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋管.
樣本處理及要求:
1. 試劑盒檢測(cè)范圍不等同于樣本中待測(cè)物的濃度范圍,建議實(shí)驗(yàn)前通過(guò)相關(guān)文獻(xiàn)預(yù)估樣本中待測(cè)物的濃度并通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定樣本的實(shí)際濃度情況。如果樣品中待測(cè)物濃度過(guò)高或過(guò)低,請(qǐng)對(duì)樣本做適當(dāng)?shù)南♂尰驖饪s。
2. 若所檢樣本不在說(shuō)明書所列樣本之中,建議做預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其檢測(cè)有效性。
3. 血清:將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)夜,然后1000×g離心20分鐘,取上清即可,或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
4. 血漿:用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本,并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃1000×g離心15分鐘,取上清即可檢測(cè),或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
5. 組織勻漿:用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,去除殘留血液(勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測(cè)量結(jié)果),稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS(一般按1:9的重量體積比,比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9mL的PBS,具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整,并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中,于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞,可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎,或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘,取上清檢測(cè)。
6. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清:請(qǐng)1000×g離心20分鐘,取上清即可檢測(cè),或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
7. 其它生物標(biāo)本:1000×g離心20分鐘,取上清即可檢測(cè)。
8. 樣品外觀:樣品應(yīng)清澈透明,懸浮物應(yīng)離心去除。
9. 樣品保存:樣品收集后若在1周內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)的可保存于4℃,若不能及時(shí)檢測(cè),請(qǐng)按一次使用量分裝,凍存于-20℃(1個(gè)月內(nèi)檢測(cè)),或-80℃(6個(gè)月內(nèi)檢測(cè)),避免反復(fù)凍融,標(biāo)本溶血會(huì)影響最后檢測(cè)結(jié)果,因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。
檢測(cè)前準(zhǔn)備工作:
1. 請(qǐng)提早10分鐘從冰箱中取出試劑盒,平衡至室溫。
2. 標(biāo)準(zhǔn)品梯度工作液配制:加入1mL通用稀釋液至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中,靜置15分鐘待其溶解后輕輕混勻(濃度為20ng/mL),然后按照以下濃度:20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL、0.312ng/mL、0ng/mL進(jìn)行稀釋。
倍比稀釋方法:取7支 EP管,每管中加入500μL通用稀釋液,500pg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品工作液中吸取500μL到第一支EP管中混勻配成250pg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品工作液,按此步驟往后依次吸取混勻。最后一管直接作為空白孔,不需要再?gòu)牡箶?shù)第二管中吸取液體,具體如下圖。
3. HRP-抗原工作液配制:使用前15分鐘將濃縮HRP-抗原于1000×g離心1分鐘,以通用稀釋液將100×濃縮HRP-抗原稀釋成1×工作濃度(例:10μL濃縮液+990μL通用稀釋液),當(dāng)日使用。
4. 1×洗滌液配制:取10ml 20×洗滌液到190ml蒸餾水中(從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶,屬于正?,F(xiàn)象,可放置室溫,輕搖均勻,待結(jié)晶溶解后再配置)。
操作步驟:
1. 從室溫平衡10分鐘后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2. 加樣:分別將樣品或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品按照50μl每孔加入相應(yīng)孔中,空白孔加入50μL通用稀釋液,緊接著每孔加入50μL HRP-抗原工作液。蓋上封板膜后37℃溫育1小時(shí)。(建議:將待測(cè)樣本用通用稀釋液稀釋1倍后再加入酶標(biāo)板內(nèi)測(cè)試,從而減少基質(zhì)效應(yīng)對(duì)測(cè)試結(jié)果的誤差影響,最后計(jì)算樣本濃度時(shí)需乘以對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)。所有的待測(cè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品在檢測(cè)中建議設(shè)立復(fù)孔)。
3. 洗板:棄去液體,每孔加入300μL 1x洗滌液,靜置1分鐘,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復(fù)洗板3次(也可用洗板機(jī)洗板)。
4. 加底物:每孔加入底物(TMB)90μL,蓋上封板膜,37℃避光溫育15分鐘。
5. 加終止液:每孔加入終止液50μL,立即在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。
結(jié)果判斷:
1. 計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品和樣本復(fù)孔的平均OD值。以濃度為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),在雙對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(作圖時(shí)去掉空白組的值)。
2. 若樣品OD值低于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限,應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè)并在計(jì)算樣本濃度時(shí)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
典型數(shù)據(jù)和參考曲線:
以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考,實(shí)驗(yàn)者需根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
濃度(ng/mL) | 20 | 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.625 | 0.312 | 0 |
OD值 | 0.19 | 0.24 | 0.31 | 0.55 | 0.97 | 1.38 | 1.96 | 2.52 |
注意:本圖僅供參考,應(yīng)以同次試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算標(biāo)本含量。
試劑盒性能:
1. 重復(fù)性:板內(nèi)變異系數(shù)小于10%,板間變異系數(shù)小于10%。
2. 回收率:在選取的健康人血清、血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入3個(gè)不同濃度水平的人SC,計(jì)算回收率
樣本類型 | 范圍 | 平均回收率 |
血清(n=8) | 81-101 | 96 |
血漿(n=8) | 92-105 | 101 |
3. 線性稀釋:分別在選取的4份健康人血清、血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入高濃度人SC,在標(biāo)準(zhǔn)曲線動(dòng)力學(xué)范圍內(nèi)進(jìn)行稀釋,評(píng)估線性。
稀釋比例 | 回收率(%) | 血清 | 血漿 |
1:2 | 范圍(%) | 83-95 | 88-96 |
平均回收率(%) | 91 | 93 | |
1:4 | 范圍(%) | 89-104 | 87-108 |
平均回收率(%) | 93 | 98 |
注意事項(xiàng):
1. 嚴(yán)格按照規(guī)定的時(shí)間和溫度進(jìn)行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。
2. 洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過(guò)程中不要讓微孔干燥掉。
3. 消除板底殘留的液體和手指印,否則影響OD值。
4. 底物顯色液應(yīng)呈無(wú)色或很淺的顏色,已經(jīng)變藍(lán)的底物液不能使用。
5. 避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯(cuò)誤結(jié)果。
6. 在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。
7. 平衡至室溫后再打開(kāi)密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。
8. 任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強(qiáng)烈氣體。任何漂白成分都會(huì)破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性。
9. 不能使用過(guò)期產(chǎn)品。
10. 如果可能傳播疾病,所有的樣品都應(yīng)管理好,按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測(cè)裝置。
郵箱:2450868877@qq.com
傳真:86-區(qū)號(hào)-傳真號(hào)碼
地址:上海市楊浦區(qū)鐵嶺路32號(hào)1519-10室